Iluminando os Meandros do Cérebro


Uma promissora combinação entre óptica e genética vem permitindo aos neurocientistas mapear e até controlar os circuitos cerebrais com precisão inédita.

Revista Scientific American - por Gero Miesenböck

Conceitos-chave

- Neurocientistas tradicionalmente têm estudado o funcionamento do cérebro estimulando e registrando a atividade de células nervosas isoladas com eletrodos. Mas esse método é indireto, tomando a análise de neurônios específicos.

- O novo campo da optogenética, que combina engenharia gênica com luz para observar e controlar grupos de neurônios, tem permitido investigar circuitos neurais individualmente - abordagem que irá revolucionar os estudos das funções cerebrais.

Em 1937 o grande neurocientista sir Charles Scott Sherrington, da University of Oxford, expôs o que viria a se tornar uma descrição clássica do cérebro em funcionamento. Ele imaginou pontos de luz sinalizando a atividade das células nervosas e suas conexões. Segundo ele, durante o sono profundo somente umas poucas partes remotas do cérebro brilhariam, dando ao órgão a aparência de um céu de noite estrelada. Mas ao despertar, "é como se a Via Láctea iniciasse uma verdadeira dança cósmica", ele pondera. "Rapidamente a massa encefálica se transforma num tear encantado, onde milhões de agulhas cintilantes tecem um padrão disssolúvel -, mas nunca durável; uma verdadeira harmonia de padrões secundários alternantes."

Embora Sherrington certamente não tenha percebido à época, sua metáfora poética abrigava um conceito científico importante, ou seja, revelava o funcionamento interno do cérebro através da óptica. A compreensão do modo como os neurônios cooperam para elaborar pensamentos e comportamentos permanece um dos problemas sem solução mais complicados da biologia no sentido amplo, principalmente porque os cientistas em geral não podem ver os circuitos neurais em ação. O procedimento padrão que investiga um ou dois neurônios com eletrodos revela apenas fragmentos de um todo, um quebra-cabeça complexo, mas incompleto. Assim, o sucesso em observar a comunicação entre os neurônios permitiria deduzir como os circuitos cerebrais se formam e como funcionam. Este conceito fascinante tem inspirado neurocientistas na tentativa de tornar real a visão poética de Sherrington.

Seus esforços deram origem a um novo campo chamado optogenética, uma fusão da engenharia genética com a óptica, para investigar tipos de células específicas. Pesquisadores já obtiveram êxito em visualizar as funções de vários grupos de neurônios. Além disso, a abordagem permitiu controlar de fato os neurônios remotamente, simplesmente ao ativar um interruptor de luz. Essas conquistas indicam a possibilidade de que, um dia, a optogenética possa desvendar os circuitos cerebrais e, quem sabe, até vir a ajudar no tratamento de certas doenças.

• Informação neural

As tentativas para concretizar a visão de Sherrington tiveram início na década de 70. Como os computadores, o sistema nervoso funciona a eletricidade; os neurônios codificam informações em sinais elétricos, ou em potenciais de ação. Esses impulsos, com tensões menores que um décimo de uma pilha AA, induzem uma célula nervosa a liberar moléculas neurotransmissoras que então ativam ou inibem células conectadas num circuito. Num esforço para tornar esses sinais elétricos visíveis, Lawrence B. Cohen da Yale University testou a capacidade de responder a diferenças de potencial com mudança de cor ou de intensidade de um grande número de corantes fluorescentes. Ele descobriu que alguns corantes de fato têm propriedades ópticas sensíveis à tensão elétrica. E tingindo neurônios com esses corantes, Cohen pôde observar sua atividade com um microscópio.

Ao reagir não a mudanças de tensão, mas ao fluxo de átomos carregados específicos, ou íons, os corantes ainda podem revelar o disparo neural. Quando um neurônio gera um potencial, os canais das membranas se abrem e íons de cálcio entram na célula, o que estimula a liberação de neurotransmissores. Em 1980 Roger Y. Tsien, hoje na University of California, em San Diego, começou a sintetizar corantes que poderiam indicar variações na concentração de cálcio, alterando a intensidade da luminescência com que brilhavam. Esses indicadores ópticos se mostraram extraordinariamente valiosos, abrindo novas janelas sobre o processamento de informações em neurônios simples e redes pequenas.

Mas os corantes sintéticos sofrem de um grave revés. O tecido neural é composto de muitos tipos de células diferentes. Estimativas sugerem que o cérebro de rato, por exemplo, comporta várias centenas de tipos de neurônios, além de vários tipos de células de suporte. Como as interações entre tipos específicos de neurônios formam a base do processamento da informação neural, para entender como um determinado circuito funciona devemos identificar e monitorar os agentes individuais e apontar quando eles são ligados e desligados. Como os corantes sintéticos colorem todos os tipos de células indiscriminadamente, em geral é impossível rastrear a origem dos sinais ópticos nos tipos específicos de células.

• Genes e fótons

A optogenética nasceu da percepção de que a manipulaç&atild de;o genética pode ser a solução para resolver este problema da pigmentação indiscriminada. Todas as células de uma pessoa contêm os mesmos genes, e o que distingue duas células entre si são as diferentes combinações de genes, ativados e desativados, em cada uma delas. Os neurônios que liberam o neurotransmissor dopamina, por exemplo, ao disparar precisam do maquinário enzimático para produzir e embalar a dopamina. Os genes que codificam os componentes desse maquinário são então ativados nos neurônios produtores de dopamina (dopaminérgicos); no entanto, permanecem desativados nos outros, não-dopaminérgicos.

Em teoria, se um interruptor biológico que acionou um gene produtor de dopamina estivesse ligado a um gene que codifica um pigmento, e o sistema interruptor-pigmento fosse construído dentro das células de um animal, este produziria o pigmento apenas em células dopaminérgicas. Se pudéssemos examinar o interior do cérebro dessas criaturas, veríamos as células dopaminérgicas funcionando, virtualmente, isoladas de outros tipos de células. Além disso, poderíamos observar estas células no cérebro ativo.

Os corantes sintéticos não podem realizar esse tipo de magia, porque sua produção não é controlada pelos interruptores genéticos, ativados somente em determinados tipos de células. O truque funciona apenas quando o corante é codificado por um gene - ou seja, quando o pigmento é a proteína. As primeiras demonstrações de que corantes codificados geneticamente podiam registrar atividade neural ocorreram há uma década, por equipes lideradas independentemente por Tsien, Ehud Y. Iasacoff da University of California, Berkeley, e por mim e James E. Rothman, hoje na Yale University.

Em todos os casos o gene para o corante foi emprestado de um organismo marinho luminescente, tipicamente uma água-viva, que produz uma proteína verde fluorescente. Nós ajustamos o gene para que a proteína produzida pudesse detectar e revelar as mudanças na voltagem ou no cálcio subjacentes realçando a célula, bem como a liberação dos neurotransmissores que permitem a sinalização entre células. Munidos desses sensores de atividade codificados geneticamente, nós e outros pesquisadores criamos animais em que os genes codificados podiam ser ativados apenas em grupos de neurônios precisamente definidos. Muitos organismos prediletos dos geneticistas - incluindo minhocas, peixes-zebra e ratos - foram analisados até o momento dessa forma, mas as moscas-das-frutas têm se mostrado particularmente prontas a revelar seus segredos diante da investida conjunta da óptica e da genética. Seu cérebro compacto é visível através de microscópio, sendo que circuitos inteiros podem ser registrados num único campo de visão. Além do mais, as moscas são facilmente modificadas geneticamente e um século de pesquisas conseguiu identificar muitos dos interruptores genéticos necessários para direcionar grupos específicos de neurônios. De fato, foi em moscas que Minna Ng, Robert D. Roorda e eu, todos à época no Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, em Nova York, registramos as primeiras imagens do fluxo de informações entre séries de neurônios em um cérebro intacto. Desde então, descobrimos novos arranjos de circuitos e novos princípios de funcionamento. No passado descobrimos neurônios no conjunto de circuitos de processamento de cheiros das moscas que parecem injetar um "ruído de fundo" no sistema. Especulamos que o barulho adicionado amplifica estímulos fracos, aumentando assim a sensibilidade do animal ao cheiro - uma vantagem na busca por alimento.

Os sensores se tornaram poderosas ferramentas para a observação da comunicação entre neurônios. Mas, no fim da década de 90, ainda tínhamos um problema. A maioria das experiências que investigam a função do sistema nervoso é muito indireta. Os pesquisadores estimulam a resposta no cérebro expondo o animal a uma imagem, um som ou um aroma e tentam chegar ao caminho resultante inserindo eletrodos e medindo os sinais elétricos captados nessas posições. Infelizmente as entradas sensoriais sofrem uma reformatação completa enquanto viajam. Assim, identificar com exatidão a que sinais se referem as respostas registradas a uma determinada distância do olho, ouvido ou nariz torna-se ainda mais difícil, quanto mais se distancia desses órgãos. Para os muitos circuitos cerebrais que, em lugar do processamento sensorial, dedicam-se ao movimento, pensamento ou emoção, a abordagem falha completamente: não há uma forma direta de ativar esses circuitos com estímulos sensoriais.

• Da observação ao controle

A capacidade de estimular grupos específicos de neurônios diretamente, sem depender de estímulo externo para órgãos sensoriais, amenizaria esse problema. A questão, agora, era se conseguiríamos desenvolver um conjunto de ferramentas que não apenas fornecessem sensores para monitorar a atividade das células nervosas, mas também que posssibilitasse a ativação imediata de tipos de neurônios específicos. Eu e Boris V. Zemelman, que atualmente trabalha no Howard Hughes Medical Institute, abraçamos esse problema. Sabíamos que se conseguíssemos programar um acionador, ou disparador, codificado geneticamente e controlado pela luz nos neurônios, superaríamos diversos obstáculos que detinham os estudos sobre circuitos neurais, usando eletrodos. Como o número de eletrodos que podem ser implantados no sujeito de um teste simultaneamente é limitado, com esta abordagem os pesquisadores conseguem ouvir ou excitar apenas um pequeno número de células por vez. Além disso, em determinados tipos de células, os eletrodos são alvos difíceis. E como deveriam ficar imóveis, impedem as experiências com animais móveis. Se pudéssemos recorrer a um interrruptor liga/desliga para nos ajudar a encontrar todos os neurônios relevantes (os produtores de dopamina, por exemplo) e usar a luz para controlar essas células sem a nossa interferência, não precisaríamos saber com antecedência sua localização no cérebro para estudá-los. E não importaria se as posições se alterassem conforme o animal se movimenta. Se a estimulação das células que contêm os acionadores despertasse uma mudança de comportamento saberíamos se essas células estariam operando nos circuitos que regulam esse comportamento. Ao mesmo tempo, ao fazer com que essas mesmas células carregassem um gene sensor, as células ativas se acenderiam, revelando sua localização no sistema nervoso. Supostamente, ao reconduzir a experiência repetidas vezes em animais isolados, para apresentar um tipo de c&e interrruptor liga/desliga para nos ajudar a encontrar todos os neurônios relevantes (os produtores de dopamina, por exemplo) e usar a luz para controlar essas células sem a nossa interferência, não precisaríamos saber com antecedência sua localização no cérebro para estudá-los. E não importaria se as posições se alterassem conforme o animal se movimenta. Se a estimulação das células que contêm os acionadores despertasse uma mudança de comportamento saberíamos se essas células estariam operando nos circuitos que regulam esse comportamento. Ao mesmo tempo, ao fazer com que essas mesmas células carregassem um gene sensor, as células ativas se acenderiam, revelando sua localização no sistema nervoso. Supostamente, ao reconduzir a experiência repetidas vezes em animais isolados, para apresentar um tipo de célula diferente contendo um acionador, conseguiríamos juntar as peças de uma sequência de eventos resultantes de excitação neural do comportamento e identificar todos os atores no circuito. Tudo o que precisávamos fazer seria descobrir um acionador geneticamente codificável que pudesse transformar um flash de luz em um pulso elétrico.

Para encontrar um acionador como esse decidimos que seria preciso verificar as células que geram sinais elétricos respondendo à luz, como os fotorreceptores dos nossos olhos. Essas células contêm uma antena que absorve a luz, chamadas rodopsinas, que, quando iluminadas, instruem os canais de íons nas membranas celulares a abrir ou fechar, alterando assim o fluxo de Íons e produzindo sinais elétricos. Decidimos transplantar genes que codificam essas rodopsinas (mais alguns genes auxiliares necessários à função da rodopsina) em neurônios cultivados em uma placa de Petri. Pudemos então testar se a luz brilbante na placa levaria os neurônios a disparar. Nosso experimento funcionou - no início de 2002, quatro anos depois do desenvolvimento dos primeiros sensores geneticamente codificados aptos a relatar a atividade neural, estrearam os primeiros acionadores codificados geneticamente.

• Moscas controladas remotamente

 Recentemente pesquisadores listaram outras proteínas fotossensíveis, como a melanopsina, encontradas em células especializadas da retina que ajudam a sincronizar o ciclo circadiano com a rotação da Terra, como sendo acionadores. E o esforço conjunto de Georg Nagel do Instituto Max Planck de Biofísica em Frankfurt, Karl Deisseroth da Stanford University e Stefan Herlitze da Case Western Reserve University demonstraram que outra proteína, chamada canal-rodopsina 2 - que orienta os movimentos das algas - está apta a esta função. Há também uma variedade de acionadores codificados geneticamente que podem ser controlados via substâncias fotossensíveis sintetizadas por nós e por Isacoff e seus colegas da U. C. Berkeley, Richard H. Kramer e Dirk Trauner.

O passo seguinte foi demonstrar que nosso acionador funcionaria em um animal vivo, desafio que propus a Susana Q. Lima. Para conseguir provar esse princípio concentramo-nos em um circuito particularmente simples das moscas, constituído de uns poucos punhados de células. Sabia-se que esse circuito controlava um comportamento incorrigível: um reflexo de fuga dramático, em que o inseto rapidamente estende suas pernas para ter impulso para abrir suas asas e voar. O disparo inicial para essa sequência de ações é um impulso elétrico emitido por dois dos cerca de 150 mil neurônios no cérebro da mosca. Esses chamados neurônios de comando ativam um circuito subordinado chamado de padrão gerador que instrui os músculos da mosca a mover seus braços e asas.

Descobrimos um interruptor genético que está sempre ativo nos dois neurônios de comando, e em nenhum outro - e um outro interruptor que fica ativo em neurônios do padrão gerador, mas não nos neurônios de comando. Usando esses interruptores preparamos moscas em que ambos os neurônios de comando e os neurônios geradores de padrão produziram nosso acionador fotoguiado. Para nossa satisfação, ambos os tipos de moscas levantaram vôo num flash de raio laser, que era intenso o bastante para penetrar a cutícula dos animais intactos e alcançar o sistema nervoso. Isso é uma confirmação de que as células de comando e geradoras de padrão participaram do reflexo de fuga, provando que os acionadores funcionaram como esperado. Como apenas os neurônios relevantes continham o acionador codificado geneticamente, eles "souberam" responder sozinhos ao estímulo óptico. Foi como transmitir uma mensagem pelo rádio para uma cidade com 150 mil residências, sendo que um número reduzido delas possuía o sintonizador necessário para decodificar o sinal, que ficou inaudível para as restantes.

Contudo, restava um dilema. Os neurônios de comando que originavam o reflexo de fuga estavam ligados a estímulos ópticos. Esses estímulos ativavam o circuito de fuga durante a transição da interrupção da luz, como acontece quando o vulto de um predador faz sombra. (Isso é evidente quando tentamos esmagar uma mosca: sempre que nossa mão se aproxima, o inseto voa, para nossa frustração.) Temíamos que no nosso caso o reflexo de fuga pudesse ser uma reação visual ao pulso do laser e não um resultado do controle óptico direto dos circuitos de controle ou de geração de padrão.

Para eliminar esse temor conduzimos um experimento terrivelmente simples: degolamos as nossas moscas. Restaram-nos então machos sem cabeça (que sobrevivem por um ou dois dias) carregando um circuito gerador de padrão no interior dos gânglios torácicos, que formam um equivalennte grosseiro da coluna vertebral dos vertebrados. A fotoativação desse circuito impulsionou os corpos no ar, que, sem isso, permaneceriam imóveis.

Embora seus voos sempre começassem com grande instabilidade e culminassem com colisões ou quedas espetaculares, sua simples existência provou que o laser controlou o próprio circuito gerador de padrão - esses animais descabeçados não podiam detectar a luz e nem reagir a ela de outro modo. (E suas manobras desajeitadas ainda mostraram vividamente que a grande inovação na aviação foi o voo motorizado controlado, e não simplesmente o voo motorizado).

Também concebemos moscas com fotointerruptores acoplados apenas aos neurônios produtores do neurotransmissor dopamina. Quando expostas ao flash do laser essas moscas se tornam repentinamennte mais ativas. Estudos anteriores indicavam que a dopamina ajuda os animais a predizer a recompensa e a punição. Nossas descobertas com as moscas corroboram esse cenário: além de mais ativos, os insetos também exploraram seu meio ambiente de for

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